#Volume 2

Media tanam kultur jaringan merupakan media yang diperlukan agar sel atau jaringan tanaman yang diisolasi dapat tumbuh dan berkembang menjadi  tanaman  yang  lengkap.  Media  tersebut  mempunyai  komposisi nutrien yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan  sesuai dengan yang diinginkan.  Kebutuhan  nutrisi  untuk  pertumbuhan  bahan  tanam/eksplan yang optimal sangat bervariasi antar jenis tanaman, bahkan di antara bagian tanaman yang berbeda.

Komposisi  media  tanam  kultur  jaringan  terdiri  dari  sejumlah  unsur yang  diperlukan  untuk  pertumbuhan  bahan  tanam/eksplan  dalam lingkungan buatan, dengan pengelompokan sebagai berikut :

1. Hara Makro (Macro Nutrient).
Hara makro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah banyak oleh tanaman, yaitu nitrogen (N),  phosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).  N merupakan komponen dalam pembentukan protein dan asam amino dalam tubuh tanaman, juga merupakan elemen pada beberapa koenzim.  P merupakan komponen pembentukan asam nukleat (DNA dan RNA) serta dibutuhkan sebagai sumber energi transfer.  K dibutuhkan untuk mengatur potensial osmotik sel tanaman.  Ca untuk sintesis dinding sel, fungsi membran dan berperan dalam aktifnya signal sel.   Mg merupakan kofaktor enzim dan komponen klorofil.   S adalah komponen beberapa asam amino dan beberapa kofaktor enzim. Media makro pada MS terdiri dari KNO3,  NH4NO3,  CaCl2.2H2O,  MgSO4.7H2O,  dan  KH2PO4.

2. Hara Mikro (Micro Nutrient).
Hara mikro adalah unsur hara esensial yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit oleh tanaman, yaitu ferum/zat besi(Fe), manganese (Mn), zinc (Zn), cobalt (Co), copper (Cu) dan molybdenum (Mo). Fe merupakan  komponen  cytochrome  yang  berperan  dalam transfer electron. Mn adalah kofaktor enzim, Zn berperan dalam sintesis klorofil dan juga merupakan kofaktor enzim.  Co adalah komponen beberapa vitamin. Cu merupakan kofaktor enzim dan berperan dalam reaksi transfer elektron.  Mo juga merupakan kofaktor enzim dan komponen dari enzim nitrate reductase. Baik hara makro maupun hara mikro, keduanya diberikan dalam bentuk garam inorganik.

3. Myo-inositol
Myo-inositol adalah senyawa golongan karbohidrat yang ditambahkan pada media kultur dalam jumlah sedikit untuk menstimulasi pertumbuhan sel pada banyak spesies tanaman. Meskipun bukan tergolong vitamin, namun senyawa ini akan terpecah menjadi vitamin C dan pectin.  Myo-inositol memiliki peran dalam pembelahan sel, digunakan dalam konsentrasi berkisar 50-5000 ppm.  

4. Zat pengatur tumbuh.
Umumnya ada dua golongan zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan dalam kultur in-vitro, yakni golongan auksin dan sitokinin.  ZPT golongan auksin yang biasa digunakan dalam kultur in-vitro adalah: indole-3- acetic acid (IAA), indole-3- butricacide (IBA), 2,4-dichlorophenoxy-acetic acid (2,4-D) dan naphthalene- acetic acid (NAA).   ZPT dari golongan sitokinin adalah: BA (Benzyladenine), BAP (6-benzyloaminopurine), 2- iP (isopentenyl adenine), kinetin (6-furfurylaminopurine), Zeatin (6-4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) dan TDZ (thidiazuron). Rasio kedua golongan ZPT ini akan mempengaruhi arah morfogenesis yang terjadi pada kultur.  Rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin akan menstimulasi terbentuknya akar, sedangkan rasio sitokinin yang lebih tinggi dari auksin akan menginduksi terbentuknya tunas.  Jika auksin dan sitokinin pada konsentrasi yang sama (rasio 1) maka akan terbentuk kalus. Untuk pembentukan kalus juga dapat digunakan 2,4-D.  Ada beberapa jenis ZPT lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro. ZPT tersebut yaitu gibberellin (GA3) untuk pembentukan tunas pada spesies tertentu, dan asam absisik (ABA) untuk pematangan embrio pada proses embriogenesis somatik.   Dalam proses pembuatan larutan stok ZPT, untuk IAA, 2,4-D dan NAA dapat dilarutkan awal dengan beberapa tetes alkohol 95% atau NaOH 1N, sedangkan untuk golongan sitokinin umumnya digunakan beberapa tetes HCL 1N atau dimethylsulfoxide (DMSO).   Jika bahan sudah terlarut oleh pelarut awal, maka baru kemudian ditambah DD water (Double distilled water) untuk mencapai volume yang diinginkan. Penggunaan pelarut awal ini diperlukan untuk menghindari terjadinya penggumpalan akibat tidak larutnya ZPT tersebut.

5. Vitamin
Vitamin dibutuhkan tanaman sebagai katalisator dalam berbagai proses metabolisme.  Vitamin digunakan untuk pertumbuhan sel serta proses diferensiasi sel dan jaringan yang ditanam secara in vitro.  Beberapa jenis vitamin yang digunakan dalam kultur in vitro adalah thiamin, nicotinic acid dan pyridoxine.  Diantara ketiganya, yang bersifat esensial adalah thiamin (vitamin B1) yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman.  Nicotinic acid dan pyridoxine (vitamin B6) dibutuhkan hanya oleh spesies tanaman tertentu.  Ada beberapa jenis vitamin lainnya yang digunakan dalam kultur in vitro namun bersifat tidak umum atau spesifik hanya untuk kultur tertentu, yakni biotin, folic acid, ascorbic acid, pantothenic acid, tocopherol (vitamin E), riboflavin, dan p-amino- benzoic acid.

6. Gula
Jenis gula yang umum digunakan dalam kultur in vitro adalah sukrosa,  jumlahnya berkisar 2-3 % atau 20-30 gram/liter media. Selain sukrosa, beberapa jenis gula lainnya adalah laktosa, galaktosa, maltosa , glukosa dan fruktosa.  Gula diberikan pada media kultur sebagai sumber karbohidrat untuk respirasi karena tanaman kultur bersifat heterotroph, tidak dapat melakukan fotosintesis untuk menghasilkan karbohidrat.     Respirasi menghasilkan energi yang digunakan oleh sel tanaman untuk melakukan pembelahan sel. Dengan demikian gula ditambahkan pada media kultur sebagai sumber energi.

7. Asam amino
Asam  amino  tidak  selalu  harus  ditambahkan  pada  media kultur, namun diperlukan untuk kultur sel dan kultur protoplas. Penggunaannya  secara  tunggal  atau  campuran  dari  beberapa asam amino.  Asam amino menyediakan sumber nitrogen untuk pertumbuhan sel. Senyawa nitrogen ini lebih mudah diserap oleh sel tanaman dibandingkan sumber nitrogen dari garam inorganik. Asam amino yang biasa digunakan adalah casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparagine, adenine, glycine, glutamine, asparagine, L-arginine, cysteine dan L-tyrosine.

8. Pemadat media
Penambahan senyawa pemadat bertujuan untuk membuat media menjadi padat maupun semi padat. Pemadat tersebut dapat berupa agar, agarose atau gellan gum. Agar dan agarose digunakan dalam konsentrasi 0.7-1.0% (7-10 gram per-liter media), sedangkan gellan gum 0.2-0.6% (2-6 gram per-liter media).  Gellan gum dijual dengan nama dagang Gellrite, Phytagel dan Kelcogel. Media kultur sebaiknya tidak terlalu padat agar penyerapan nutrisi dapat berjalan baik.  

Teknik Pembuatan Media Kultur
Kebutuhan media dan larutan stok diartikan sebagai kebutuhan akan jumlah bahan media dan larutan stok yang harus dipenuhi pada waktu yang diperlukan  pada  beberapa  macam/tahap  kegiatan  kultur  jaringan. Kebutuhan media ini dapat dibedakan atas kebutuhan per kegiatan kultur jaringan  per  satuan  waktu  tertentu  dan  kebutuhan  untuk  total  kegiatan kultur jaringan per satuan waktu tertentu.

Kebutuhan media ini secara rinci dihitung berdasarkan tahapan- tahapan pekerjaan yang berkaitan dengan pemakaian media, yaitu: tahap inisiasi kultur (penumbuhan awal eksplan), tahap penggandaan propagul (tergantung   frekuensi   penggandaan),   tahap   pembesaran   kultur   sampai planlet siap diaklimatisasikan.
 

Pencampuran Bahan Media Kultur
Cara   mencampur bahan media untuk pembuatan media 1 liter adalah sebagai berikut : masukkan ke dalam erlenmeyer berukuran 1 liter aquades kira-kira 300 ml, larutkan gula diikuti mio-inositol kedalamnya setelah gula larut sempurna dengan diaduk secara merata. Larutan-larutan stok dimasukkan satu per satu, setelah satu bahan melarut diikuti bahan yang lainnya.. Hasil pencampuran media dituangkan dari erlenmeyer ke labu takar atau gelas ukur untuk ditepatkan volumenya menjadi 1 liter, dengan menambah aquades.
Pengaturan pH Media Kultur
Kisaran nilai pH yang dipandang paling sesuai untuk kebanyakan media kultur jaringan untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan sel-sel tanaman antara 5,6-5,8. Pada nilai pH yang terlalu asam (< 4>

Pemasakan Bahan Media Kultur
Media dalam panci dimasak pada kompor sambil diaduk-aduk  menggunakan pengaduk pada pemanas kompor. Setelah mendekati keadaan   mendidih   (sudah   mulai   keluar   titik-titik   gelembung   sebelum menjadi gelembung besar), pemanasan dihentikan.

Sterilisasi Bahan Media Kultur
Setelah  pembuatan  media  agar  selesai,  media  dibagi-bagi  ke  dalam botol-botol penanaman, dalam satu botol tanam berisi kurang lebih 20-25 ml. Selama proses pemindahan media ke dalam botol-botol penanaman sangat memungkinkan terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme, baik bakteri atau jamur. Agar mikroorganisme yang masuk ke dalam media tidak dapat berkembang biak maka perlu dilakukan sterilisasi terhadap media tersebut sebelum digunakan untuk menanam. Sterilisasi media kultur bisa dilakukan dengan menggunakan uap panas pada suhu 121o  C, dengan tekanan 15-17 psi, selama 20-30 menit. Alat yang dIgunakan untuk sterilisasi adalah autoclave. Sterilisasi media tidak boleh terlalu lama karena bisa  menyebabkan  penguraian  gula,  degradasi  vitamin  dan  asam-asam amino, inaktivasi sitokinin dan zeatine ribosida dan perubahan pH media. Media yang sudah disterilkan bisa disimpan terlebih dahulu pada ruang penyimpanan. Setelah minimal 3 hari disimpan dan media aman dari kontaminan, media kultur siap digunakan untuk menanam.

 

Oleh   : Rena Afrieska Apriliani, S.P (petugas lab. kuljar)

Editor : Anny Dufi